style="width:3.39337in;height:4.79336in" /> 本文是学习GB-T 25166-2010 裙带菜. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了裙带菜[Undaria
pinnatifida(Harvey)Suringar]主要形态构造特征、生活周期与繁
殖、遗传学特征以及检测方法。
本标准适用于裙带菜的种质检测和鉴定。
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有
的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
NY/T 5283—2004 无公害食品 裙带菜养殖技术规范
裙带菜[Undaria pinnatifida (Harv.)Suringar]。
褐藻门(Phaeophyta)、 褐子纲(Phaeosporeae)、
海带目(Laminariales)、翅藻科(Alariaceae)、裙带菜 属(Undaria)。
藻体明显分为固着器、柄和叶片三部分。裙带菜孢子体外部形态见图1。
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1—— 固着器； 4——孢子叶；
2——柄； 5—— 中肋。
图 1 裙带菜孢子体的外部形态
GB/T 25166—2010
由多次双分枝的圆柱形假根组成，其末端有吸盘。
扁平，其腹背隆起而稍圆，柄的边缘有狭窄的龙骨。藻体接近成熟时，在柄的两侧形成耳状孢子叶，
孢子叶定义见 NY/T 5283—2004 中的3.3。
褐色具光泽。幼时长盾形，边缘光滑无缺刻，为单叶。成藻为羽状裂片，叶片的中部是由柄部延伸
而来的中肋，中肋扁平隆起直达叶片的顶端。成藻一般长1.0 m～2.5 m,宽50
cm～100 cm。
由一层个体小、排列紧密和整齐的细胞组成，呈栅栏状。细胞含粒状色素体。
外皮层细胞呈柱状，大小不等，排列不整齐。内皮层细胞大小相近，排列较整齐。
细胞呈丝状或树枝状，排列疏松。
明显的孢子体(2n,大型)与配子体(n,微型)不等世代交替型。
裙带菜的生命周期为一年。
8个月～12个月。
孢子体柄部产生孢子叶，孢子叶上产生孢子囊群，孢子囊内形成游孢子。游孢子单细胞，梨形，长
9μm～11μm, 宽 5 μm～6μm, 有两条侧生不等长鞭毛，长的14.0μm～16.5μm,
伸向前端，短的
5.3μm～7.0μm, 伸向后端。
卵配方式。雄配子体产生精子囊，每个精子囊产生一个梨形精子，精子(n) 长 4
μm～5μm。 雌配 子体产生卵囊，每个卵囊产生一个卵(n),
卵成熟后排出体外粘着在卵囊口处与精子结合生成合子
(2n)。
孢子体细胞染色体数2n=60。
6.2.1 ITS- 1 序列：总长度242 bp。
1 ccgatcagga aggggacacc ctectgacac taccgtcgtg cgcgtcggtt ttgtaaaccc
cgagaaagaa
71 aatcgttacg cgatgttggg cgaggggcgc ctcgecgagg gttaattcec tcgaatcaaa
gcgcacccca
141 cttttcaace ccattaaact ctgaatctga actcaaaagg ggggcatgcg cgcgcccgcg
cgcgcggctc
211 ccccaacctt taacgttgta aaactttcag cg
6.2.2 ITS-2 序列：总长度273 bp。
GB/T 25166—2010
1 ccectecctc cccctctctt tgtggggggg gggggggttt cggggcggac tatgagtgtt
ccggagcgtc
71 cgcgctecga gtgcacccaa tctcgtgaac gaagcctctc gcgcectgcc gcacagagtt
gttgacggcg
141 ctcgcttcgg cggcgactct cgactcacca aacgtgcgcg gggattcgcc tgcttcattc
cggctcatgc
211 cttttecece ceceegccec cacgcaagtg agggagggag ggaaggagag gecatatcca
cac
6.2.3 裙带菜不同品系核糖体ITS 全序列(ITS- 1+ITS-2)
变化幅度为0～10个碱基。
采用肉眼和显微镜观察相结合的方法。
压片法。
2%地衣红溶于70%的乙酸中。
固定材料在自来水中浸泡15 min～30
min后压片。揭开盖片，滴入乙酸地衣红后盖片0.5 h,用滤
纸吸出多余的染色液，石蜡封片。
7.3.1 裙带菜配子体基因组 DNA 的提取
取约1g (湿重)的裙带菜配子体，加少量石英沙和PVP-40,
在液氮中研成粉末。将粉末转至50 mL
的离心管中，加入15 mL 裂解缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA,1.0
mol/L NaCl,
1.0% CTAB,1% SDS,pH=8.0),在65℃保温1
h,期间摇匀几次。用等体积的酚：三氯甲烷：异戊
醇(25:24:1,体积比)抽提两次，再将水相转移至一新的50 mL
离心管中，加入1/10体积 RNA 酶，
37℃保温1
h,再用三氯甲烷：异戊醇(24:1,体积比)抽提一次，用2/3体积的异丙醇沉淀回收
DNA。
DNA 最后溶于100 μL 的 TE(10 mmol/L Tris-HCl,pH=8.0;1 mmol/L
EDTA,pH=8.0)中。
总反应体积为20μL,含10 mmol/L Tris-HCl,pH=8.3,50 mmol/L KCl,1.5 mmol/L
MgCl₂ ,
Taq polymerase 1U,4 种 dNTP 各2 mmol/L, 两个引物各4 mmol/L～6
mmol/L(正向引物 P1:5'-
CGCGAGTCATCAGCTCGCATT-3'; 反 向 引 物 P2:5'-AGCTTCACTCGCCGTACTGG-3'), 模
板
DNA 10 ng,其余用双蒸馏水补满。
PCR 反应参数：96℃预变性5 min;96℃,30 s;72℃,60 s;55℃,30 s,37
个循环；72℃,保温
参照 DNA 测序仪进行测序(参见附录 A)。
被检样品完整并符合本标准第4章要求的为合格样品。如被检样品不完整需增加第5章、第6章
内容进行检验，均符合上述质量要求的为合格样品。
GB/T 25166—2010
(资料性附录)
DNA 序列的测序
A.1 测序样品预处理
PCR 扩增完毕，将样品置于-20℃条件下。利用PCR
产物纯化试剂盒进行纯化。具体操作如下：
a) 往 PCR 产物中加入4倍体积75%异丙醇，室温沉淀30 min。 在3200 r/min
下离心30 min;
b) 去掉上清，加8倍体积75%异丙醇。室温静置10 min;
c) 在3200 r/min 下离心10 min, 去上清；
d) 在 5 0 ℃ 烘 干 3 min
以除去残留的异丙醇，或置于温箱中盖上保鲜膜至无异丙醇；
e) 加入适量的无菌去离子水稀释，1000 r/min 振荡混匀。
A.2 测序
A.2.1 纯化后的PCR 产物在 ABIPRISM 3730 测序仪上采用 Sanger
双脱氧链终止法原理从两端进
行测序。
注：本标准以 ABIPRISM
3730测序仪为例，不排除采用具有同等工效的其他型号的测序仪。
A.2.2 设立双脱氧测序反应。要求：
a) 引物：测序引物即为扩增引物；
b) 微量滴定板：为96孔 U 形微量滴定板；
c) 链延伸-链终止反应混合液的配制。
A.2.3 测序凝胶的制备。
A.2.4 准备样品和列表，上样到微量滴定板中进行测序。
A.2.5 电压160 V/cm, 温度42℃。
A.2.6 根据凝胶的荧光放射自显影，运用计算机读取 DNA 序列。
A.3 数据处理
利用相关的生物信息学软件读取所测裙带菜 ITS 序列，并同 GenBank
中公开的近缘种序列进行比
对，确定裙带菜ITS (包括ITS-1,5.8S 和 ITS-2)
序列的起点和终点。利用软件MEGA 计算裙带菜不同
品系 ITS 序列的变异数目。
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